周 刚 1 #，苏衍龙 2 #，秦 毅 4，徐家康 5，王礼伟 1，秦 彤 3，谢 鹏 2,汪国莲 1，刘 颖 2 *，秦进华 1 *

（1.江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所，江苏 淮安 223399；2.淮阴师范学院，江苏 淮安 223300；3.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100091；4.江苏省农业科学院休闲农业研究所，江苏 南京 210023；5.淮阴区三树镇农村工作局，江苏 淮安 223399）

人类和其他脊椎动物的肠道内寄居着庞大的微生物群，主要成员是细菌，同时还包括病毒、真菌、原生动物等，作为一个整体，它们之间相互竞争、协同和拮抗，从而影响宿主的健康和行为。健康的肠道微生物组在较长时间内保持相对稳定，但是微生物的丰度可以在外界干扰下发生变化，例如大量抗生素的摄入、饮食结构的剧烈变化等，如Hildebrand等研究发现使用抗生素干扰可使宿主肠道菌群发生长期改变。大量研究表明肠道菌群通过易位进入血液后，可通过微生物相关分子模式（LPS、dsRNA等）来激活宿主的模式识别受体（TLR、NOD1/2等），参与心血管疾病的发病机制。在动物和人体研究中发现，系统性炎症性疾病与肠道微生物组中产短链脂肪酸菌数量下降相关。在人类医学临床应用中，粪菌微生物移植（Fecal microbiota transplantation，FMT）是治疗艰难梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）的有效方法，而粪便银行的建立将推动FMT成为更易获取和安全的治疗方法。

在人类医学上利用FMT作为标准化的治疗手段进行使用，还需要大量的长期随访数据，FMT的潜在影响仍是未知或尚未发现的，特别是一些基于肠道菌群组成变化诱发自身免疫性疾病的潜在关系还需进一步研究。猪作为一种杂食哺乳动物，除了在消化系统的解剖学结构和生理特性与人类相近外，其肠道内的优势菌群也与人具有高度的相似性，主要包括厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门和螺旋菌门等，因此利用猪作为研究FMT的模型动物将在一定程度上加速推进人类FMT的研究进程。

1 FMT与人类疾病治疗

1.1 FMT可改善肠道微生物组紊乱

正常成年人的体内由总数约为3.8×1013 个微生物组成复杂的微生态群落，这些微生物通过集体代谢活动与宿主相互作用，为机体提供基本的代谢和生物学功能，例如提供能量、刺激免疫系统和产生定殖抗性等。健康成年人的肠道中细菌种类最多，由超过2 000种细菌构成核心微生物群，其中从胃到结肠的细菌密度和丰度都在逐渐增加。健康的肠道微生物群是一个具有功能冗余性的微生物生态系统，而现在越来越多的研究表明，肠道菌群在疾病的发病机制和发展进程中发挥了重要作用，但关于肠道菌群与疾病之间的因果关系和基本机制还没有阐明，只知道FMT可能是通过（图1所示）途径改善肠道菌群进而影响疾病进程。肠道微生物群与机体健康的密切关系为FMT进行相关疾病治疗成为潜在可能。跨物种FMT证实肠道菌群失调可导致乳腺炎，在不摄入酒精的情况下利用FMT调节肠-肝轴，可改善酒精性肝病。赖氨酸特异性组蛋白脱甲基酶5（lysine-specific demethylase5，KDM5）功能的丧失与智力残疾和自闭症有着重要联系，刘星吟等人利用果蝇KDM5突变型模型，揭示宿主的基因突变与以肠道微生物为代表的环境因素之间的相互作用相关，通过靶向肠道菌群的干预，在一定程度上可以改善果蝇的异常社会行为。

1.2 FMT可改善短链脂肪酸生成

短链脂肪酸（Short-Chain Fatty Acids，SCFAs）是饲粮纤维发酵的产物，结肠中专性厌氧菌的种类和数量是影响其产生的主要因素。SCFAs主要包括乙酸、丙酸和丁酸等，其中拟杆菌门主要产生乙酸和丙酸，厚壁菌门主要产生丁酸。不同器官对SCFAs有着不同的代谢特征，乙酸在小肠中被利用为机体提供能量，从而参与心脏、大脑以及肌肉的代谢。丙酸经结肠吸收后通过肝脏的代谢成为组织能源，有研究表明在结肠中增加丙酸可以减少腹腔内脂肪组织分布和肝细胞内脂质含量；巨噬细胞可清除入侵机体的病原体，在巨噬细胞分化期间，丁酸可抑制组蛋白脱乙酰酶3，从而驱动巨噬细胞的代谢变化、增强其抗微生物活性，提高抗肠道病原体的能力。此外，SCFAs能降低结肠pH，提高其酸性环境，从而减少有害菌的生长，防止肠道功能紊乱，进而维持肠道微生物生态系统。SCFAs在调节免疫系统和炎症反应方面也发挥重要作用，SCFAs作为一种非特异性的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可抑制结肠癌细胞的增殖、分化和转移，诱导癌细胞凋亡，控制原癌基因的表达，继而防止结肠癌变的发生。FMT通过增加或减少特定菌群（如霍氏真杆菌、微生子梭杆菌、双歧杆菌、AKK菌）或直接转移SCFAs来影响SCFAs代谢。II型糖尿病与SCFAs产生不足有一定关系，利用FMT将一些已经鉴定出的与SCFAs产生相关的细菌进行移植，或以这些关键细菌为靶点用个性化营养方案来防治II型糖尿病。

1.3 FMT可治疗艰难梭菌感染

艰难梭菌（Clostridioides difficile，C-diff）是一种革兰阳性厌氧芽孢条件性肠道致病菌，广泛存在于自然界以及人和部分禽畜的粪便中，艰难梭菌芽孢在环境中抵抗力较强，耐高温、耐氧气、耐乙醇。艰难梭菌其主要的毒力因子是毒素A和毒素B，作用于肠道而导致肠道炎症和组织病变，进而可引起人的伪膜性结肠炎，甚至导致死亡。对艰难梭菌感染（clostridium difficile infection，CDI）患者和模式动物的研究表明，肠道固有菌群可以抑制C-diff的繁殖并降解其产生的毒素，从而不会表现出致病性。但由于近几年广谱抗生素的滥用，导致肠道菌群失调，CDI 发病率逐年上升，其较高的复发率和病死率，给治疗带来了一定困难。Khanna等人研究发现，复发性艰难梭菌感染（recurrent Clostidium difficile infection，rCDI）患者经过FMT治疗后肠道微生物多样性显著增加，同时通过FMT可成功治疗rCDI。最近的一项Meta分析得出结论，FMT可以在高达90%的患者中解决CDI症状。

2 猪FMT技术应用及前景

2.1 猪FMT与健康养殖

肠道微生物群在宿主体内起着十分关键的作用，包括提供保护性肠道屏障、消化和代谢营养素以及调节免疫力等。许多变量可影响猪最初几周内肠道微生物的定植，包括母猪的阴道、皮肤和粪便微生物群、母乳和饲料消耗量、猪舍和猪只栏环境、病毒和细菌感染、抗菌剂使用以及屠宰或运输过程中的应激。这些因素可能影响猪只整个生产周期的微生物群组成。越来越多的证据表明肠道微生物是影响疾病的重要因素，对肠道微生物群的控制为预防疾病提供了新的思路和方法，粪便移植（Fecal Microbiota Transplantation，FMT）就是这样一种新型的调控手段，FMT还被研究作为提高家畜饲料效率的潜在工具。研究发现，猪只配种前增加饲粮纤维可促进卵母细胞成熟、提高胎儿期存活率和产仔数。我国饲粮纤维类型多样，产量丰富且相比其他种类饲料具有一定的价格优势，但现阶段却不能科学地利用，造成了极大的浪费。在生猪养殖中，合理利用FMT改善猪只肠道菌群以提高母猪对饲粮纤维的利用，对改善母猪的繁殖性能、提高母猪终身产仔数具有巨大的应用潜力。Hu 等人（2018）将成年金华猪粪便移植到杜长大三元仔猪中，发现外源粪便菌群可以通过调节肠道菌群的组成对猪生长性能、肠道屏障功能和先天免疫有显著影响。目前我国母猪的年生产力远低于欧美等发达国家，而当国外品种肌间脂肪达到4%以上时，我国地方猪种的高肌间脂肪的特点也将不再突显。肠道菌群对改善人类肥胖的研究给了人们一定的启示，如果利用肠道菌群FMT技术定向改变中国地方猪种的高背膘、低瘦肉率的特点，将提高我国猪肉的国际竞争力。

FMT在猪疾病治疗中也具有很好的应用前景。抗菌药使用不当致使的药物残留和耐药问题日益突出，发展无抗养殖是中国未来养猪业保障猪肉安全的趋势，肠道菌群中的益生菌与病原菌直接或间接的相互作用从而影响疾病的进程，通过FMT技术移植益生菌可达到减少利用抗生素治疗疾病的作用。供体粪便中的微生物多样性决定了FMT成功与否，而FMT中“超级供体”的提出，对于未来肠道微生物群的鉴定和为更有针对性的细菌治疗方法提供可能。韩新燕团队利用大肠杆菌K88感染新生仔猪为模型，发现FMT能触发大肠杆菌K88引起的肠黏膜自噬，减轻肠屏障损伤。家养动物肠道单优势菌的出现与抗生素的大量使用有着极大的关系。随着有益菌群在生长和免疫方面的作用得到进一步的确定，在畜禽生产中利用FMT进行益生菌移植来替代抗生素和生长促进剂将成为可能。

目前，关于艰难梭菌相关疾病（Clostridioides difficile–associated disease，CDAD）的研究大部分都是在人类上，对于动物源性艰难梭菌（Clostridioides difficile，C-diff）的研究较少，但C-diff是一种公认的导致初生仔猪肠炎的病原体之一，欧美和其他国家C-diff在初生仔猪中检出率非常高（根据毒素检测呈阳性），在CDAD中若仅考虑CDI的直接影响，仔猪病死率可能较低，所以并没有引起人们的重点关注。但在受感染的畜舍中无临床症状的仔猪也可发现C-diff及其毒素，对于缺乏护理的母猪C-diff常常导致无乳症。在FMT治疗人CDI非常有效的背景下，可以利用FMT来治疗猪只的CDI，以减少CDI的发病率，同时利用仔猪还可以为人类CDAD的各个方面提供适当的模型。

除了在动物性疾病治疗中的潜力外，FMT在预防动物腹泻和提高动物自身免疫力方面的用途也同样值得重点关注。目前我国的猪病预防与治疗过分地依赖疫苗和药物，从而导致猪群长期处于亚健康状态，猪病发生在很大程度上并不是由病原微生物引起的，而是与其自身免疫力下降有着巨大关系，增强猪只自身的免疫系统对于现代的养猪生产极为重要。猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）与猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是猪场常见的两种导致猪免疫抑制的病毒，PRRSV与PCV2的混合感染对全球猪肉生产造成了重大经济损失。最新的研究还表明，FMT可以作为猪圆环病毒相关疾病（porcine circovirus associated disease，PCVAD）的预防工具，接受FMT的猪只PCVAD相关临床症状减少，猪生殖与呼吸综合症病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）和猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2，PCV-2）病毒复制减少，体重增加，两种疾病的抗体数量增加。可见，肠道微生物和粪便微生物移植是用于改善猪只健康并预防疾病的潜在方法。

2.2 猪FMT技术方法与标准化

肠道微生物组的构成受多种因素的共同作用，但宿主遗传背景在其中的影响程度一直不明确。近日，Rothschild等研究证明肠道微生物组没有显著的家族遗传倾向，宿主遗传背景在决定微生物组的组成方面影响甚微。共同生活在一起但没有亲缘关系的人群，微生物群落的组成却具有高度相似性，饮食和地理环境是决定微生物群落结构和功能的两个主要因素。在不用考虑宿主遗传背景的影响下利用FMT来改善仔猪肠道菌群组成，生产中可以使用标准化的FMT流程进行移植，这将使得降低在商品化饲养条件下仔猪疾病的发生和促进生长变得易行有效。在目前的研究与应用中，对于FMT的具体操作过程尚无统一标准，制定相关行业标准或操作规程将对FMT的开展和广泛应用产生巨大的推动作用。菌群移植主要涉及到供体筛选、粪便处理、受体准备、移植介入方式、移植次数等过程。FMT首选移植介入方式仍在探索阶段，上消化道可以通过口服胶囊、口服粪便菌液或鼻十二指肠管；下消化道可以通过结肠镜、灌肠等方法进行粪便微生物移植。在猪生产中实施FMT技术，从实际的可操作性首先应当考虑采取粪便菌液添加于日粮中进行饲喂或口腔直接灌服的方式。建议参考Hamilton等人研究制定猪FMT粪便菌液标准化的制备方法，称取供体猪粪便（从大便中间取样，供体粪便最好为6 h内）于合适的无菌容器，加入无菌生理盐水，为了保护厌氧菌需要在充满氮气的生物专用柜中进行粪样匀浆，然后使用不同规格的实验筛逐次过滤粪液，以除去未消化的食物残渣和颗粒物质，将滤液在低温离心机中离心，弃去上清，对沉淀使用无菌生理盐水重悬制成粪便菌液，制备好的粪便菌液可以直接进行移植。如进行粪便菌液进行冻存，需添加10%无菌甘油，然后-80℃冻存24 h后，浸入液氮中进行长期保存，为了保证粪便中微生物的活性，应尽量避免反复冻融。粪便菌液的复苏要在FMT灌注的当天进行，粪便菌液在37℃水浴中快速解冻，且在解冻开始后6 h 内进行移植。

2.3 建立猪粪便银行

使用FMT技术的同时存在着传播疾病的风险，特别是像非洲猪瘟等烈性传染病，一旦暴发将对养猪业造成灾难性的后果。猪粪便银行的建立让粪液质量控制和移植全程追溯成为可能，从而对FMT技术的安全性提供保障。猪场在进行FMT后若产生严重的不良反应，粪便银行也可提供紧急救助，更为重要的是粪便银行数据库可以采集所有接受FMT技术养殖场的使用数据，从而进行更深层次的试验研究，如在菌株水平进行追踪分析，将某些可预防仔猪腹泻的特定菌株鉴定出来，发现特定肠道微生物与宿主互作的关系，同时为利用益生菌替代抗生素来预防动物腹泻提供可靠依据。

猪粪便银行可以在科研机构、地方政府或国家督导等层面上运作。粪便库的主要目的是提供预先筛选出来源明确、高质量、随时可用的供体粪便悬浮液，从而使FMT治疗变得安全、简单、经济。冷冻粪便是标准化FMT流程和按需求提供粪便的最佳方法，根据Lee研究结果显示，使用标准化冷冻粪便与使用新鲜粪便在治疗CDI的病例时效果无统计学差异，因此建立猪粪便银行并使用标准化冷冻粪便菌液进行FMT在猪生产中具有可行性。猪粪便银行工作流程如图2所示。

3 小结 

FMT在人类医学领域的成功应用为其在养猪生产中的应用提供了很好的启示和指导，反之，FMT在人类医学上的大规模应用还需要大量的临床试验去确保安全性，而在养猪生产领域上的研究和应用将成为推进FMT在人类医学应用的催化剂。随着猪标准化FMT方案的制定，同时针对每个单独的适应症对FMT方案进行标准化的优化，以证明针对特定疾病微生物发挥靶向治疗的潜力，将使人们可以更好地理解FMT治疗的机制。粪便银行对供体的安全性和移植结果进行统一控制，对FMT的长期安全性有了保障。相信未来通过对肠道菌群的深入了解，并不断完善FMT技术，将对人类医学和生猪健康养殖都具有重要意义和推动作用。

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