“海南育奇”推荐阅读【主题策划】规模化猪场非洲猪瘟采样检测关键点和常见误区
点击量:2125时间:2021-10-27来源:猪业科学

 

 张小刚,李雪平等 猪业科学 

摘要

近年来,非洲猪瘟疫情对国内养猪业的冲击很大,严重影响了大中小型规模化猪场的发展和利润,也给养猪业造成了巨大的损失。然而,随着非洲猪瘟病毒自然和非自然变异株的大量出现,对ASFV传统采样和检测须得到一些新技术的支持,如“唾液/深咽拭子+血液”抗原抗体同步采样检测、多重PCR以及微滴数字PCR等。基于此,文章归纳总结了规模化猪场采样和检测的关键点和常见误区,以期为国内规模化猪场现场采样和检测方面提供理论借鉴。

关键词

非洲猪瘟(ASF);非洲猪瘟病毒(ASFV);采样;检测

  自从2018年8月国内暴发第一例非洲猪瘟(African swine fever,ASF)疫情起,规模化猪场的发展模式就从快速转为稳健,生产流程都围绕着ASF防控为前提。在ASF防控过程中,对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的采样和检测十分重要。截止稿前,随着多种变异毒株的出现,国内很多大中小规模化猪场都经历了“发病-清场-复产-发病”的过程,其中多数是由于猪场ASFV采样存在交叉扩散,以及检测不及时、不准确、检不出等原因造成的。

 

  因此,文章总结了当前规模化猪场现场采样和检测的一些关键点和常见误区,以期防止国内规模化猪场再次出现“发病-清场-复产-发病”无限死循环的现象。

 

1  猪场ASFV采样关键点及注意事项

 

1.1  猪场采样规范

1.1.1  成立应急采样专业队

  中大型猪场应根据场内人员编制,提前成立应急采样专业队,可以由饲养员组成(可考虑各组/环节抽人组成,可兼任日常异常猪场采样监控),采样专业队建议由队长、副队长及4名队员组成(分两组进行,风险高低分开),队长和副队长分别带队进行采样并监控队员采样规范性,并具有采样防污染及发生污染应急处理能力;应急采样队可以根据实际情况兼任本公司区域内其他猪场的采样(最好省内,考虑到人员能否及时到位),特殊情况除外,有条件的尽量配备应急采样专业队。

 

1.1.2  采样培训、准备到位

  平时培训好采样专业队对猪只(大栏/定位栏、大中小猪只、血液/唾液/咽拭子)、环境(重点是猪舍内区域,包括但不限于栏杆、过道、风机、门把手、工具、水鞋等)的采样,准备好采样方式使用的棉拭子、纱布等。在猪场出现异常情况下,人员能够快速到位组建采样队,确保在最短的时间里完成猪群几轮的普筛,第一时间找到感染猪只。

 

1.1.3  采样效果监控与评估

采样专业队队长及副队长应该由公司负责技术的一把手考核认定,具有全部类型标准采样操作能力,队长对队员们采样是否规范进行培训和考核,并对他们进行打分,尽可能减少可知错误采样操作,要求全部队员都能通过考核后才算采样队成立。猪场要时刻注意是否在过程中需要后补人员,防止队员在需要时出现特殊情况,通常需要提前多预留一些人员进行培训考核,保障发生异常情况时人员能够及时补充。

 

1.1.4  关注采样准确性

  采集唾液时,猪只咀嚼时间不得小于10s,确保收集到足够量的唾液。采集咽拭子时,应用棉绒拭子快速捅到咽喉,防止采集到的大部分是唾液,最好拔出时观察是否有黏液(鼻涕状),若没有,建议重新采一次。唾液或咽拭子采样尽可能控水断料,控水尽可能在30min以上,不喂料有利于猪只唾液分泌,另外也促进猪只应激,激发排毒作用,有利于提高部分猪只的检出率。采集血液准,虽然前腔静脉血、耳根血较尾根血较准,但前两者相对操作较难,通常需要保定猪操作,若大批量采集仍建议尾根血较为稳妥,不过采尾根血也注意保护自身,避免血滴落到鞋上而扩散到其他区域(通常操作完一条过道尽可能换一次鞋套等)。

 

  环境采样要求在消毒前或者与上一次间隔12h(经验值)后采样,避免消毒药对检测带来的影响。一般来说,在猪场各个区域都需要日常消毒,但监控环境是否带毒,需要避免消毒药(破坏核酸的消毒剂氯制剂、过氧乙酸、烧碱)的影响。如果采集的样品中含有消毒药,那消毒药可能将采集到的核酸降解,这样可能会结果误判,影响下一步的环境消毒。应注意如果采用戊二醛等无法裂解核酸的消毒药,如果之前环境样检出阳性,那无论采用这些消毒药消毒多久,此时采样必要性不强(属于无效采样)。采样要在理论上行得通,而不是一刀切,一“采”到底。

 

1.1.5  采样队自身防护与监控

  采样队进出猪舍、猪舍内操作以及当天跨单元/栋等须严格控制防止交叉污染,做好冲凉、穿戴防护服、手套(胶手套+PE手套)、鞋套操作流程,防止扩散(这些都有正确的标准操作程序,需要注意);每次采样结束后,每个采样队员对自身头发、脸、手、鞋底、外衣裤等进行采样,评估采样过程中是否存在污染扩散的现象,此过程可以通过专业采样队员互相协助采样,尽量采样精准到位。

 

1.1.6  猪场非洲猪瘟采样方面注意事项

  小型猪场(低于1500头母猪)建议各区域有采样责任人,必要时可以考虑全员皆“兵”,既所有干部员工都非常熟悉采样的全部流程;另外无论猪场大小,平时都需要做好日常异常/非正常猪只采样监测;任何采样队在采样过程都可能会出现扩散的可能,因此无论任何一种采样方式都需要严格监控人员操作(监控方式可以双岗制、视频监控如配执法仪等,方便后续复盘与改正),避免污染扩散。

 

1.2  猪场送样规范

1.2.1  编号信息完整简洁

  采样管(不同规格EP管)清晰表明样品信息编号,编号通常由场部根据栋舍规定,如第1栋用A1→An;第2栋用B1→Bn,以此类推。若实验室为区域实验室(涉及多个猪场,应在前面表明好猪场代号,最好也是单个字母),其次各区域将编码对应的唾液/咽拭子/血液/环境等类型对应,并且注明猪只栏号或具体环境区域,再由猪场统一将送检表发至实验室。具体见表1。

 

1.2.2  样品固定防污染

  为防止样品溢撒,要求样品编号好放入样品盒中进行固定,并且对EP管盖再一次进行按压,确保管盖盖紧,在送样过程不会被震动崩开。通常多数猪场很少配备足量的样品盒,可采用硬皮纸板/泡沫板替代(根据PE管大小间隔插孔)编号插入后,将盖子再按压一次,确保都盖紧后,再在盖子上方用一层未插孔的硬皮纸板/泡沫板盖住,用橡皮筋捆绑好,并在其上次标注好采样时间、编号、区域和各类型样品份数以及总份数。

 

1.2.3  场内送样流程可控

  样品由生产线送至猪场大门口过程中,要确保单向流程,样品做好双层包装,避免存在潜在风险传播到不同区域,尤其是大门口。整个传递过程由专人负责,防止交叉污染。

 

1.2.4  送实验室规范

  将上述样品,由场部统一收集,按规定时间送样,安排专车第一时间送至实验室(各猪场按实际情况确定,最好15:00前送样,及时送样可以在当天出结果)。要根据实验室人员、设备、检测项目、检测强度等情况,合理安排样品送检数,避免样品长时间存放或实验员夜班疲劳检测,影响样品检测的及时性和准确性。若实验室较近且实验室能第一时间检测,样品盒可考虑不用加冰;若实验室较远或者实验室待检样品过多(同时检测几个猪场样品等特殊情况),需要在样品盒中加入适当的冰块。

 

2  猪场ASFV检测关键点及注意事项

 

2.1  专业人员操作

2.1.1  实验员持证上岗

  实验操作人员需要培训合格上岗,非专业人员可能会存在漏检,错位检、错误检等情况,影响检测准确性和时间性,大大影响到实际生产过程中的“拔牙”/隔离等操作。了解样品检测混样检测原则,通常核酸混样不超过5个。抗体不得混样。

 

2.1.2  掌握新技术手段

  由于ASFV变异毒株的大量出现,传统单重PCR不能满足变异毒株的鉴定,并且部分未及时采样猪只检测后,会出现抗原无法检出,但抗体能检出的情况。因此在当前背景下,要掌握多重PCR、抗原抗体同步检测以及微滴数字PCR等多项新技术手段,确保能够准确鉴定、检出,甚至实现痕量核酸的检出。

 

2.1.3  定期培训与考核

  定期(最好半年)对实验员进行理论和实操等方面进行培训考核,包括操作流程、各类实验设备仪器的操作和使用,结果的准确判断,异常情况处理等,尽可能减少紧急状况下出现异常结果,让实验室的检测结果有真实指导意义,而非误导。

 

2.1.4  仪器设备精密高效

  要求检测抗原抗体仪器设备(含移液枪、漩涡器等)要具有设备稳定、准确性高、寿命长、性价比高以及与试剂盒磨合度高等多种优势。移液枪需要定期校准,并且每次实验结束后要调至最大刻度,防止弹簧压死,影响移液准确性。

 

2.1.5  试剂盒选择要科学合理

  用于ASFV抗原抗体检测的试剂盒必须具备批内和批间稳定性高,灵敏度高、准确性高、性价比高等特点,确保能将不同变异毒株准确检测出来。包括病毒DNA/RNA提取试剂盒、鉴别ASFV野毒株和CD2V/MGF基因缺失毒株三重荧光PCR检测试剂盒、非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒(UNG)、非洲猪瘟抗体间接ELISA检测试剂盒(p30)、非洲猪瘟抗体C-ELISA检测试剂盒(p54)等多种抗原抗体检测试剂盒,用于对猪场不同毒株的检测。

 

2.2  实验数据精准分析

2.2.1  检测结果判定准确

  实验室人员要根据检测试剂盒说明书将实验结果准确判定,如对扩增曲线的读取和异常评估,通过CT值判断阴性、可疑和阳性值以及对抗体阳性值的计算和判定,这些需要实验员都熟透于心,确保不出现任何差错。

 

2.2.2  异常结果复检合理化

  对于异常数据,实验员对原样品需进行一次复检,包括对核酸提取和反应扩增等,若复检检测阴性,则判断阴性。若复检结果仍然出现异常,要根据结果果断判断是否要求猪场进行同1头猪只再采样(适当时候可以结合环境样/血液样同步评估),重复采样后根据检测结果,实验室给出具有指导意义的检测结果。

 

2.2.3  猪场非洲猪瘟检测方面注意事项

  CT值容易因为样品被生理盐水等的稀释导致升高,如果样品稀释过多,虽不影响阳性判断,但容易影响现场对下一步的操作,比如“拔牙”的力度和区域等。

 

 2.3  实验室防污染

  实验室容易受到实验样品、阳性对照、实验操作、扩增产物、样品废弃物等的污染,如果处理不当,很容易造成检测结果出现异常。尤其在当前病毒低毒株横行的时期,如果实验室污染造成实验结果阳性偏多,那对于猪场“拔牙”损失也是巨大的,所以实验室防污染是十分重要的。

 

2.3.1  选用防污染的检测试剂

  如为防止PCR室扩增产物的污染,可以选用加入UNG酶的试剂盒,可大大减少扩增产物的气溶胶污染。

 

2.3.2  实验员操作规范

  实验员需要具有很强的生物安全意识。正常情况下,进入到实验室需要冲凉更衣,这些大型企业是具备条件的。但中小型猪场实验室目前不具备这种条件,这就需要实验前洗手(或者消毒湿纸巾擦拭手脸等)、换实验服以及换鞋等操作,尽可能防止外界将风险传到实验室内,又可以避免实验室污染扩散到外界。

 

  样品预处理需要特别小心实验污染,如唾液大棉签可以采取螺丝钉方式进行离心取样,如果采取挤脱方式,不小心会造成实验室地面及样品污染,甚至污染到实验员本身,导致实验室整体污染。在加入阳性对照时,要在特定区域或空旷区域加入,加样时要特别小心,避免洒落和枪头的无害化处理,确保阳性对照不会污染实验室或污染到其他样本。

 

2.3.3  实验室合理分区

  实验室根据不同功能区可以分成试剂配制区、核酸提取区、核酸扩增区等三大区,有条件的猪场还可以增加物资储备区、样本处理区和废弃物处理区等。正常区域应该配有传递窗(具有仅能单一打开的双层门,含有紫外照射)方便样品传递以及防止外界污染。各区域要控制好空气流动,防止由于气溶胶循环污染。

 

2.3.4  实验室日常消毒和监测

  通常实验室每天对台面等区域进行清理清洁,并采用84消毒液进行日常消毒;通常情况下,操作台、自动抽提机、实验室各区域,每天操作结束后需要定时紫外消毒,包括每天晚上,定时照射紫外半小时以上;移液枪、离心机、PCR仪、抽提机等需要定期用84消毒液进行消毒,必要时需要厂家专业人员进行拆洗,如移液枪等设备;定期对实验室人员、地面、操作台、各处理间、仪器设备等进行采样检测评估(空气沉降法和表面擦拭法),评估是否实验室造成污染,如果出现污染,立即对实验室进行消杀,确保实验操作不受污染。

 

2.3.5  实验废弃物处理

  废弃物包括猪场送样的风险样品(预处理前)、预处理过程中使用的枪头/一次性手套等、抽取样品和核酸以及阳性对照的枪头、核酸提取反应板、扩增后产物等。这些物品通常需要高压灭菌(121℃ 30min)后再处理,也可以在合适区域,加入柴油等及时进行焚烧处理。应注意存在阳性风险的实验废弃物不得在空地长时间放置,要避免动物媒介将污染扩散,任何废弃物建议第一时间处理或密封存放。

 

2.4  实验室设备维护

2.4.1  定期维护

  实验室移液枪需要定期维护好(包括定期厂家校准,正常半年一次;并且每天上下午实验结束后要调至最大刻度,防止弹簧压死,影响移液量),避免出现漏液、少液等情况,以免导致实验结果不太精准。

 

2.4.2  及时清理消毒

  全自动抽提机和PCR仪需要及时清理、消毒,每次做完实验后,及时定期进行紫外照射,长时间不用设备时,可以考虑及时将电源关闭,避免长时间待机不使用,影响使用年限。

 

2.4.3  避免受潮及断电保护

  实验室设备要进行适当合理分区摆放,设备放置区域要保住通风干燥,通常与冰箱以及清洗区适当分开,有利于避免设备受潮,而降低设备的使用寿命。贵重设备建议安装设备断电保护器,防止运行时断电可能造成对设备的损坏情况等。

 

3  猪场非洲猪瘟采样检测过程的一些常见误区

 

3.1  生物安全意识低

  若采样未成立专业采样队,采样过程和消毒过程一样,都可能会发生不小心导致疫情扩散的情况,若非专业队操作,可能会导致阳性猪样品扩散给其他猪只。并且在送样过程中未对样品进行固定摆放(样品盒或纸板等),容易导致某个样品溢出后污染全部样品,导致检测结果不准确。送样过程未做到专人单向运输,或者传递完样品后又接着送生产物资等,可能造成全场交叉污染,对生物安全的威胁巨大。

 

3.2  猪场现场采样不合理

3.2.1  环境采样不合理

  注意消毒药的影响,尤其是氯制剂、过氧乙酸等容易对核酸进行降解的消毒药,若这类消毒药对环境进行消毒后不得立即采样,应注意药物挥发后再采样。另外若用戊二醛消毒,采样检测ASFV核酸也是没有必要的。

 

3.2.2  唾液样品采集不到位

  猪只咀嚼时间不足,或者未控水采样,导致部分低毒量猪只无法检出的情况,无法及时对阳性猪只进行清除,从而导致阳性猪只长期存在而传染给周边猪只或同栋其他区域猪只。

 

3.2.3  异常猪采样不确保

  若无法采集到猪只唾液(不咀嚼棉签或长时间未喝水导致口干),建议深部咽拭子采样,若仍然采集不到,可以考虑采集血液或者猪头能接触的栏杆料槽等环境样,确保尽可能收集到能准确评估猪只状况的样品。

 

3.3  实验室操作不专业

3.3.1  实验员培训不到位

  实验员对实验操作不熟悉,可能导致加样时混样、串样或者污染其他样品,导致阳性样本污染阴性样本的情况,影响实验结果。另外检测过程中也需要防止各种污染,包括日常进出实验室操作、日常消毒和监控以及污染物的无害化处理等措施。

 

3.3.2  样品合并检测不合理

  抗原检测时,核酸混样超过5个,这样容易导致检测结果不准确,如部分病毒量比较低的样品可能会由于混样导致检测阴性。抗体混样检测会增加实验操作,而且对出结果的时间也会大大降低。

 

3.3.3  处理不当造成假阴性

  实验室或采样人员处理样品时,可能会存在样品采集不足或运输过程风干等情况,实验员可能涉及到加入稀释液或缓冲液将样品进行稀释,但如果检测结果与实际偏差太大,容易导致生产一线对疫情暴发程度的误判,容易导致现场制定错误的清除策略。

 

3.3.4  实验数据分析不准确

  非专业人员,不会判断仪器设备出现故障或者出现异常,则很容易导致误判,影响到生产一线的下一步操作。

 

3.3.5  仪器维护不及时

  实验室移液枪等未定期维护好(或日常未调节好刻度),可能存在漏液、少液等情况,影响到检测结果,导致实验结果不太精准;其他设备应定期清理清洁,并且电源要定时关 闭,设备最好不要长时间处于待机状态。

 

3.3.6  使用低性价比的产品

  实验设备不稳定、试剂盒准确度和灵敏度不高,虽然价格上占优势,但得出的结果和实际偏差很大,往往会导致猪场带来严重的后果。建议选用高品质的实验设备和试剂盒,配套全方位正确方案,才能让猪场实际生产得到保障。

 

4  总结

 

  我们知道,ASF疫情一直都是可防可控,即使变异病毒的出现算是雪上加霜,国内仍有大量规模化猪场“拔牙”成功,表明只要控制好生物安全、采样检测、猪群流动等一系列关键点,任何毒株造成的疫情都能成功稳定控制。我们坚信,在有效疫苗出现前的若干时间里,在国内规模化猪场采样和检测环节,若能做到人员操作行为专业、方法手段新颖好用、污染扩散控制有效、检测分析精准可靠等一系列关键节点,一定能将ASFV拒之大门之外;哪怕有ASFV进入到猪场,也能借助科学手段做到精准快速清除,继而实现猪场稳定生产。

 

本文选自《猪业科学》2021年第10期“主题策划”栏目:P30-34(版权归《猪业科学》所有,如转载,请注明出处)。阅读更多内容可见网站:http://www.csis.cn。

 

 

 

 

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