“诗华诺倍威”推荐阅读【猪场兽医】华南猪群猪急性腹泻综合征的诊断和病原鉴定
点击量:120时间:2018-11-01来源:猪业科学

 

作者:贺东生,李锦辉,刘博闻,李 根,陈敏鸿

 

 

摘 要

2017年11月,华南某猪场新生仔猪出现急性呕吐和严重水样腹泻、体重迅速减轻和急性死亡,病死率90%~100%。经实验室PCR诊断,排除猪流行性腹泻(PED)、猪传染性胃肠炎(TGE)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)等常见腹泻传染病后,诊断为猪急性腹泻综合征(Swine acute Diarrhoea Syndrome,SADS),由一种新型的蝙蝠冠状病毒(SADS﹣CoV)引起。针对其编码的N基因设计一对特异性引物扩增该片段并测序,使用DNAStar和MEGA7.0软件进行同源性分析。

 

结果:成功克隆了该病毒的N段基因,序列长度为1155bp,进行了基因测序和遗传进化分析,序列同源性分析确证该毒株属SADS﹣CoV,命名SADS﹣CoVHN17。

 

关键词

猪急性腹泻综合征(SADS);SADS-CoV;鉴定;N基因;序列分析

 

 

冠状病毒对人和家畜的危害严重。2002年由冠状病毒(SARS-CoV)造成非典型性肺炎在中国南方暴发,导致超过8000人感染和774人死亡。2018年3月马静云等在国外杂志《Nature》报道了在华南某猪场发生急性腹泻疾病暴发的病例中分离鉴定出1个新的HKU2相关蝙蝠冠状病毒——猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine Acute Diarrhoea Syndrome Coronavirus SADS-CoV)。本研究再次检测到该病毒并首次在国内报道。

 

猪急性腹泻综合征的临床症状与其他已知的猪肠道冠状病毒引起的临诊症状非常相似:严重且急性呕吐和腹泻,新生仔猪体重迅速减轻导致急性死亡。该病可感染各种年龄的猪,但对新生仔猪的影响最为严重,在5d或更小日龄的仔猪中,死亡率高达90%,病后2~6d死亡,而感染的母猪只有轻度腹泻,大多数母猪在两天内恢复。组织病理学检查显示发病仔猪的肠绒毛萎缩变短。

 

SADS与人的非典(SARS)在地理、时间、生态和病原学方面存在惊人的相似之处,引起极大关注。同时,冠状病毒的多样性和蝙蝠的地理分布之间存在重要关联。随着规模化、集约化养猪业的持续发展,猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)已经或可能给养殖业带来潜在的重大经济损失。目前在国内该病尚缺乏快速有效地诊断方法和防控手段。本病是新发病,国内杂志缺乏报道,本文再次确证该病的存在和危害,同时对该病的诊断方法和病毒遗传变异进行了系统研究,报道如下。

 

 

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材料与方法

 

1.1 材料

1.1.1 病料来源

病料于2017年11月采集自华南地区发生严重腹泻的某猪场,该猪场发病仔猪表现为急性呕吐和严重水样腹泻,新生仔猪(小于5日龄)急性死亡,病死率高达100%(含淘汰)。病猪临床表现为精神不振,新生仔猪体重迅速减轻导致急性死亡,疑似为SADS-CoV感染。采集病猪的肠道病料并保存在-80℃低温冰箱,检测为常规腹泻病原阴性。数月后了解SADS-CoV,重新取出检测。

 

1.1.2 主要试剂

DNA Marker,dNTP,Taq酶等购自宝生物工程(大连)有限公司,pMD19-T载体、DHSa感受态细胞、DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒均购自Omega公司,DNA产物纯化试剂盒购自TaKaRa公司,溴化乙锭、氨苄青霉素、IPTG为Sigma公司产品;其余的化学试剂均是进口或者国产分析纯。引物合成、DNA测序由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。

 

1.1.3 培养基

氨苄青霉素(100mg/mL),LB液体培养基、LB固体培养基,LB选择培养基等按常规方法配制。

 

1.2 方法

1.2.1 样品处理

将待检病料按照1:3加入PBS缓冲液进行稀释研磨,-20℃反复冻融3次,12000r/min离心15min后取上清液,用0.22um的微孔过滤器过滤除菌,置于-80℃保存备用。

 

1.2.2 病毒总RNA的提取

按RNA提取试剂盒说明书提取病毒核酸,然后-80℃冰箱保存备用。

 

1.2.3 引物设计与合成

本实验室根据GeneBank所发布的序列号,选择全基因序列,运用Primer Premiers5.0针对N基因设计1对SADS-CoV引物。由北京睿博兴科生物技术有限公司合成,引物序列见表1。

 

1.2.4 SADS-CoV HN17N基因的PCR扩增

以病毒RNA为模板进行PCR扩增,反应体系为:2×l stepBuffer 10uL,R Nase Freed H2O 5.6uL,上下游引物各0.5uL,DNA模板3uL,Prime Script 1 step Enzyme Mix 0.4uL。PCR扩增程序为:50℃反转录30min;94℃预变性5min;94℃变性30s;51℃退火30s;72℃延伸1min20s;45个循环;72℃延伸10min;4℃保存。取6uLPCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测,CLINX凝胶成像系统拍照观察。

 

1.2.5 基因的克隆和测序

将阳性PCR产物经纯化回收后与PMD-19T载体连接,转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中,涂布含氨苄青霉素(100mg/mL)LB平板,37℃培养后挑单个菌落接种含氨苄青霉素(100mg/mL)LB液体培养基,37℃下150r/min摇菌培养12h,提取质粒DNA并进行鉴定,鉴定成功的重组质粒送往华大基因公司进行测序。

 

1.2.6 基因序列分析

将PCR扩增获得的基因片段进行克隆、测序,利用DNAStar和MEGA7软件处理,与GeneBank上已公布的5株PEDV参考毒株、5株TGEV参考毒株、5株PDCoV参考毒株和5株SADS-CoV参考毒株的基因序列(表2)进行N基因同源性比对及遗传变异分析。

 

 

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结果与分析

 

2.1 病料PCR检测结果

以提取的RNA为模板,用SADS-CoV的N基因引物对样品进行检测。结果所示(见图1),SADS-CoV在1155bp左右有明显条带,检测结果为阳性。

由此说明该病毒为SADS-CoV。将SADS-CoV PCR产物纯化后构建至pMD-19T质粒并进行测序,成功克隆了该病毒的目标序列,并获得N段基因序列,序列长度为1155bp。将SADS-CoV与GeneBank上已公布的5株PEDV参考毒株(表2)、5株TGEV参考毒株、5株PDCoV参考毒株和4株SADS-CoV参考毒株的基因序列进行N基因同源性比对及遗传变异分析。

 

2.2 SADS-CoV HN17株N基因的序列同源性分析

SADS-CoV基因组ORF区编码蛋白由ORFab、S、NS3、E、M、N、NS7a组成。在结构蛋白中,N基因主要编码病毒的核衣壳蛋白,N蛋白在病毒的复制和致病力中具有多种可能,因此,N基因作为诊断SADS-CoV的靶基因的前景非常大。将SADS-CoV HN17株N基因测序结果和在GeneBank上已公布的5株PEDV参考毒株、5株TGEV参考毒株、5株PDCoV参考毒株和5株SADS-CoV参考毒株的基因序列进行N基因同源性比对及遗传变异分析,用DNAStar软件进行同源性分析(图2)

 

分析结果表明,SADS-CoV HN17株N基因与GeneBank上已公布的SADS-CoV参考毒株的核苷酸同源性为98.2%~99.8%;与已公布的PEDV参考毒株的核苷酸同源性为54%~55.8%;与已公布的TGEV参考毒株的核苷酸同源性为48.5%~49.2%;与已公布的PDCoV参考毒株的核苷酸同源性为35.9%~37.5%;该毒株与已公布的SADS-CoV参考毒株的核苷酸同源性均达到98%以上。

 

2.3 基于SADS-CoV HN17株N基因的遗传进化分析

以表2中的PEDV参考毒株、TGEV参考毒株、PDCoV参考毒株和SADS-CoV参考毒株为参考,运用MEGA 7.0软件采用Neighbor-Joining聚类分析方法构建基于N基因序列的进化树(图3)。SADS-CoV HN17N基因与SADS-CoV DCD7、SADS-CoV 57、SADS-CoV DCD7 FarmA属于同一分支,而与PEDV、TGEV、PDCoV毒株的亲缘关系较远。本次鉴定毒株为猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV),命名为SADS-CoV HN17。

 

 

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讨  论

 

自SARS暴发以来,随着人们对冠状病毒研究的加深,冠状病毒被认为是重要的病原体,而蝙蝠被认为是新型病毒最重要的宿主。2018年马静云等首次报道猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)在华南的暴发,并将研究成果以论文的形式发表在国际杂志《Nature》上。本论文的研究是再次验证在华南某猪场中的存在猪急性腹泻综合征的暴发。本研究鉴定出的SADS-CoV HN17经N基因遗传进化分析显示:该病毒与报道的猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)在本来保守的N基因中出现变异,在遗传树上属于不同的毒株小分支,且其S蛋白存在较大的差异。

 

此外,在病料库中更早期的另一个猪场病料中也检测为阳性,推测该病毒已在华南地区猪场不断变异和蔓延扩散,有流行扩大的趋势。为了进一步证明SADS-CoVHN17的致病性,本文在以上研究基础上进行了病毒的分离和动物回归实验,获得了成功,结果另文报道。

 

猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)是新发现的一种新型冠状病毒,目前,国内外对该病尚未开展全面系统的研究。考虑到该病毒导致仔猪发病率高、死亡率高及其对仔猪危害严重的临床意义,迫切需要进一步加强其生物学特性以及致病性研究,提供防控预案,挽回养猪产业的经济损失。

 

 

致 谢:本实验是在华南农业大学兽医学院、人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室、农业部兽用疫苗创制重点实验室和广东省兽用生物技术研究与应用企业重点实验室帮助下进行。感谢广东省生猪产业体系创新团队基金的资助。

 

 

 

本文选自《猪业科学》2018年第10期“猪场兽医”栏目:P80-82(版权归《猪业科学》所有,如转载,请注明出处)。

 

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