“武汉中博”推荐阅读【猪场兽医】猪流行性腹泻病毒与链球菌混合感染的诊断 | |||||
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作者:胡兴义,张双翔,冯旭芳,丁尊俄,刘丽娟,蒲翠敏,张 海,周碧君,王开功 随着我国养殖业的规模化、集约化发展,猪病毒性腹泻已成为威胁我国养猪业发展的主要原因之一。猪病毒性腹泻的病因十分复杂,主要的病原有猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪嵴病毒(PKV)。这4种病毒均能引起猪的肠道传染病,感染后主要表现为严重腹泻、呕吐、脱水和仔猪的高死亡率,各种年龄的猪均易感染,其中对哺乳仔猪的危害最为严重,发病率可达100%。这4种病原所致腹泻其临床症状和病理变化极其相似。此外,当前猪腹泻也多存在细菌感染,如大肠杆菌、链球菌、沙门氏菌和猪丹毒等感染所致,且存在混合感染的情况,单从临床上鉴别诊断较难,给养殖户专业技术人员用药增加难度。因此通过实验室诊断技术对猪腹泻进行病原诊断尤其重要,也为猪腹泻疫病的诊断和药物选择提供帮助。
2017年2月贵州省贵阳市某规模化养猪场发生腹泻大流行,导致其哺乳仔猪大量死亡。笔者通过对该猪场3头哺乳弱仔猪进行剖检和实验室诊断,特做如下报道。 1 材料 1.1 临床样本 来自贵州省贵阳市某种猪场3头产房哺乳弱仔猪。
1.2 主要试剂 RNA提取试剂盒购自北京世纪元亨动物防疫有限公司;反转录试剂盒和PrimeScriptTMRT Master Mix购自宝生物工程(大连)有限公司。营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、鲜血营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基,购自杭州微生物试剂有限公司;新生牛血清购自浙江天航生物科技有限公司。草酸铵结晶紫、革兰氏碘液、95%酒精、沙黄染液、生理盐水由贵州大学预防兽医学实验室自制。 2 方法 2.1 剖检病理观察 对送检的3头哺乳弱仔猪进行解剖,沿其腹白线切开,钝性剥离腹内膜,观察其免疫器官和肠道的病理情况。采集其肠道组织和粪便。
2.2 病原核酸检测 取送检猪的粪便、肠等组织,研磨,离心提取上清,采用北京世纪元亨猪流行性腹泻病毒检测试剂盒提取总RNA,针对PEDV 特异性引物(目的片段444 bp)进行RT-PCR扩增,产物通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。
2.3 引物设计与合成 根据PEDV M基因保守序列设计一对特异性引物,并送上海英俊生物有限公司合成,引物序列见表1。
2.4 反应体系建立 反应体系为25μL,2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL,上下游引物各1μL,模板RNA 2μL,灭菌ddH2O8.5μL。
反应条件:94 ℃预变性3 min;95 ℃变性30 s,56 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,35个循环;72 ℃最后延伸7 min,4 ℃保存。
PCR反应结束后, PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测,观察其结果。
2.5 细菌分离培养 取送检猪的肝脏、肺脏、肾脏、空肠、心脏以及脾脏等组织分别接种于鲜血琼脂培养基、麦康凯培养基、普通琼脂培养基上,37 ℃培养24 h,并挑取单个细菌进行革兰氏染色及显微镜观察。 3 结果 3.1 剖检病理变化结果 对送检的3头哺乳弱仔猪进行剖检,表现肠系膜淋巴结出血,颌下淋巴结出血等症状。主要剖检图片如图1和图2。
3.2 病原核酸检测结果 通过对送检的3头哺乳弱仔猪进行取材,经总RNA提取,反转录和PCR扩增,取7 μL扩增产物上样于1.2%琼脂糖凝胶电泳分析结果。结果显示,猪流行性腹泻病毒检测结果为阳性,扩增条带与预期结果一致,表明送检3头哺乳弱仔猪为PEDV感染所引起,见图3。
3.3 细菌分离培养结果 取送检的3头哺乳弱仔猪的肝脏、肺脏、肾脏、空肠、心脏以及脾脏等组织分别接种于鲜血琼脂培养基、麦康凯培养基、普通琼脂培养基上,37 ℃培养24 h,可见多种脏器分离到细菌(见图4)。经革兰氏染色镜检,肝脏和心脏部位接种所生长的细菌为革兰氏阳性球菌,生化鉴定初步确定为链球菌(见图5)。
3.4 细菌药敏试验结果 挑取纯化细菌做药物敏感试验,37 ℃培养12~16 h,结果见图6和表2。 由表2结果可见,分离到的细菌对多种药物均不敏感,可用肠道康等相似药物进行防控。 4 小结 通过对送检的3头哺乳弱仔猪样本进行猪流行性腹泻病毒病原核酸检测,结果显示,送检样本中均存在猪流行性腹泻病毒感染,建议加强免疫。尤其是哺乳仔猪阶段,临床上建议采用跟胎免疫方法,使哺乳仔猪获得保护性抗体。经细菌培养显示,该猪场存在链球菌感染,在寒冷季节应加强哺乳仔猪饲养管理,强化猪舍环境卫生管理,提高圈舍内的温度,及时补糖补液、适时止泻、按时驱虫及免疫,定期消毒,消毒药物的种类交替使用。
本文选自《猪业科学》2017年第8期“猪场兽医”栏目:P85-86(版权归《猪业科学》所有,如转载,请注明出处)。
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